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    ELISA檢測試劑盒的組成

    發(fā)布時(shí)間: 2015-04-13  點(diǎn)擊次數(shù): 2682次

    1.抗體 在 ELISA檢測試劑盒 中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗)。多抗取白免疫動(dòng)物的抗血清,制備較簡單,但抗血清成分復(fù)雜,除含針對抗原(多個(gè)表位)的抗體外,還含有多種其他抗體,親和力和特異性相對要低于單抗,且制備周期長,批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位,親和力和特異性均較多抗高,且制備技術(shù)成熟,產(chǎn)量大,批間差異小,但結(jié)合位點(diǎn)的單一也正是其弱點(diǎn)之所在,在雙抗體夾心法中,如包被和指示抗體使用同一單抗,則由于結(jié)合位點(diǎn)的缺乏,容易造成假陰.性結(jié)果。在使用雙單抗一步法時(shí),應(yīng)注意抗原過剩時(shí)的“鉤狀效應(yīng)"
    2.抗原 在ELISA中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類,即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高,特異性不強(qiáng);合成抗原一般為多肽片段,缺乏天然抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)表位,親和力不高,可能導(dǎo)致相應(yīng)表位的抗體漏檢;基因重組抗原具有安全、特異性強(qiáng)、親和力高、產(chǎn)量大等特點(diǎn),是一種比較理想的抗原,但其純化比較困難。
    3.包被 將免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)結(jié)合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等;常用的方法有吸附法、化學(xué)交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法,特別是后一方法,效率高,ELISA檢測試劑盒而且可用以包被不易吸附在固相上的各種免疫活性物質(zhì)。具體做法是先將鏈霉親和素包被在固相載體上,然后使與生物素化的抗原或抗體與之結(jié)合。由于親和素與生物素之間的高親和力,抗原或抗體即間接結(jié)合在親和素包被的固相上.
    4.酶和底物 在 ELISA檢測試劑盒 中zui常用的酶為HRP和ALP。
    (1)HRP:是一種糖蛋白,含糖量約18%,分子量為44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為五色糖蛋白,在275nm波長處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),是酶的活性基團(tuán),在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3.0。HRP質(zhì)量的另一重要指標(biāo)是酶活力,以單位(unit,U)表示。用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)≥250U/mg。HRP的作用底物為H202,催化下列反應(yīng);
    DH2+H202 HRP D+2H2O
    上式中DH2為供氫體(即底物),H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高,除H2O2外,僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種,在ELISA中常用的有:鄰苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2,2,-azino-bisc(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有優(yōu)缺點(diǎn):OPD是在ELISA中應(yīng)用zui多的底物,靈敏度高,比色方便,但配成溶液后穩(wěn)定性差,且有致異變性;TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍(lán)色,加酸終止反應(yīng)后顯,目測對比鮮明,可比色定量,溶液的穩(wěn)定性也較差,但無致異變性,因此應(yīng)用日見增多;ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
    (2)ALP:是一種磷酸酯的水解酶,用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U/mg以上。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽(PNP),降解產(chǎn)物為的對硝基酚。經(jīng)NaOH終止酶反應(yīng)后,顏色維持比較穩(wěn)定。
    在ELISA中酶作用于底物后生成有色物質(zhì)、熒光物質(zhì)或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光,分別可用分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)測量及照度計(jì)測量。熒光和化學(xué)發(fā)光測定的敏感度均高于比色測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍亦較比色反應(yīng)寬,測定效果優(yōu)于常用的比色ELISA。
    5.固相載體 固相載體是ELISA檢測試劑盒中用以分離結(jié)合標(biāo)記物和游離標(biāo)記物的主要手段,應(yīng)與各種免疫活性物質(zhì)有良好的結(jié)合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。

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